RIP 的基本原理
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用抗体捕获细胞核内或细胞质中内源性的RNA结合蛋白。
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免疫沉淀把RNA结合蛋白及其结合的RNA一起分离出来。
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结合的RNA序列通过定量RT-PCR或高通量测序（RIP-Seq）方法来鉴定。
实验方法
01
蛋白A琼脂糖凝胶和抗体的固定
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取被protein-A包裹的磁珠悬浮液，先用PBS洗涤，然后用NT2缓冲液洗涤磁珠两次。
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将NT2缓冲液和BSA添加到磁珠悬浮液中，在室温下搅拌培养2小时。
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将抗体添加到上述步骤得到的混合物中，然后在室温下孵育1小时。
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用NT2缓冲液洗涤protein-A包被的磁珠，然后搅拌3min，1000g，离心1min，重复此过程5次。
02
细胞裂解物的制备
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将细胞先转移至离心管，然后在4℃，1000g，离心10min；
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细胞用预冷的PBS洗涤两次；
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加入与细胞等体积的RIP裂解液重悬细胞，轻轻地吹打均匀于冰上静置5min；
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每管分装400 μL细胞裂解液，于-80℃冰箱保存；
03
免疫沉淀反应
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将上述步骤得到的细胞裂解液4 °C，14000 g，离心10 min；
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取清液到一个新的离心管中，4 °C，14000 g，离心5 min，再将上清液再转移至另一个新的管子中；
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在制备的上清液中加入10倍体积的NET-2buffer重悬的磁珠，吹打混匀；
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取约10%的样品作为“Input”备份，−80 °C保存备用；
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在裂解液中加入10倍体积的NET-2 buffer重悬的磁珠，作为阴性对照；
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接着在4℃恒温搅拌下孵育12-16h；
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孵育后，离心分离protein-A包被的磁珠，取出10%上清备份“output”；
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用NT2缓冲液洗涤磁珠，将其重悬后并混合3min，然后4℃，1000 g离心，重复6次。
RNA的分离与分析
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将Trizol加入到等体积的磁珠中，并将混合物重新悬浮，RNA立即被分离或冷冻在液氮中。
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检测RNA的浓度和质量，并通过RT-PCR和测序鉴定RNA.
RIP实验中常见问题及解决办法
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非特异性RNA的结合过高
在室温下搅拌培养2小时，可以减少mRNA与磁珠的非特异性相互作用。
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分离得到的RNA水平过低
实验过程中需确保细胞中有足够水平的蛋白质。
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