核糖核酸酶保护实验(Ribonuclease protection assay.RPA)基本原理是将标记的特异RNA探针(32P或生物素)与待测的RNA样品液相杂交标记的特异RNA探针按碱基互补的原则与目的基因特异性结合.形成双链 RNA:未结合的单链RNA经RNA酶A或RNA酶T1消化形成真核糖核酸.而待测目的基因与特异RNA探针结合后形成双链RNA 免受RNA酶的消化。对于32P标记的探针杂交双链进行变性聚丙酰胺凝胶电泳,用放射自显影或磷屏成像系统检测被保护的探针的信号:对于生物素标记的探针.杂交双链经过变性聚丙酰胺凝胶电泳后电转移至尼龙膜 采用链富亲和素-辣根过氧化物酶(Streptavidin-HRP)和化学发光底物与膜上biotin标记的探针结合X射线胶片或化学发光图像分析仪检测杂交信号，
与Northem杂交相比.核糖核酸酶保护实验灵敏度更高:由于没有PCR扩增的步。避免了PCR扩增造成的偏移 可以更准确的反应RNA的丰度 在一个反应体系中可以同时检则多个指标
完整的RPA实验包括探针的制备/标记、杂交、RNaseA消化、变性聚丙酰胺胶电泳和信号检测等步
骤。具体操作如下
一、探针的制备/标记
探针的制备一般使用体外转录的方法进行。
1.载体构建及PCR
构建含有探针序列的质粒。
设计含有17或SP6启动子的PCR引物注意:PCR产物是探针的模板.所以启动子序列在下游引物中。
2.体外转录
利用体外转录体系以PCR产物为模板合成探针。常用的体外转录体系如下
4 ul 5倍转录缓冲液2ul 0.1 M DTT
4 ul 2.5 mM NTP(A.C.G)
0.8 ul RNA酶抑制剂(25 U/ pl)(Promega)100 pM 标记UTP(32P)
1 ul RNA聚合酶SP6.T7或T3
总体积 20 ul。孵育1小时37℃。
二、杂交
1.探针纯化
可以使用QIAGEN公司的QIAquick核苷酸去除试剂盒或Boehringer离心柱(G50葡聚糖凝胶)进行。
2.杂交
RNA提取后溶于杂交缓冲液调整浓度为1ug/uL.8pL RNA中加入2uL探针.95C变性5分钟.40-55℃孵育4小时(孵育温度根据探针的溶解温度确定)。
3.消化
1)加入RNAse消化液.37℃保温30分钟
2)加入10%的SDS10puL蛋白酶K(10ug/uL)20pL37℃保温10分钟。
3)苯酚-氯仿抽提,取上清。
4)异丙醇或无水乙醇沉淀RNA。
5)洗涤、溶解沉淀。
三、聚丙酰胺凝胶电泳
电泳方法同常规的SDS-PAGE电泳。
四、检测
放射自显影检测。
注:探针也可采用非放射性标记(如:生物素标记),那么随后的检测也需要按照非放射性标记的流程进行。
探针 方法一方法二方法三
在一个反应体系中使用了6种探针,3种不同的实验方法进行实验,每一种方法重复3次(Tam Thuan NguyenJeffrey B Smith.2002) 。
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