面对这些残忍的现实时,我们该怎么抉择?重复一次?换个蛋白?换个抗体?显然这些方案都不是更佳的方案。
为了避免出现以上问题 现在就给大家梳理一下western blot中常见问题以及对应的解决方案。
1、条带形状不好看怎么回事?
可能的原因有:
1.凝胶的不均匀或聚合不好,应对策略---灌胶前将溶液充分混匀。
2.样本卦浓度较高.应对策略_--样本进行除卦或者将样本卦浓度调成一一致
3..缓冲液多次使用,导致成分发生变化,应对策略---重新配制。
4.凝胶下部有气泡.应对策略---电泳前先赶走气泡。
5.电泳时温度过高应对策略---降低电流或电压。
2、没有条带是怎么回事?
可能的原因有:
1.二抗的HRP活性太强将底物消耗光,应对策略---降低二抗的浓度。
2.ECL底物中H2O2不稳定.失活.应对策略_--更换ECL。
3. ECL底物没有覆盖到相应的位置,应对策略---重新洗膜之后再次曝光。
4.一抗使用不当或者二抗失效应对策略---在有效期内使用抗体,并对应来源。
3、背景高咋回事呢?
可能原因有：
1.洗膜不充分,应对策略---建议增加洗液体积和洗涤次数。
2.电封闭不彻底应对策略---提高封闭液的浓度,孵育时间,保证封闭液完全浸没转印膜封闭物使用不当比如检测生物素标记的蛋白时不可以用脱脂奶粉,应对策略---针对不同的蛋白使用不同的封闭物。
3.抗体非特异性结合,应对策略---可以降低抗体的浓度或者减少孵育的时间。
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